雖然早期預(yù)防及支持**有顯著的療效，但其發(fā)病率和病死率仍居高不下。細(xì)胞**是目前**AKI具有良好前景的策略，旨在促進(jìn)損傷腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)。其中間充質(zhì)干細(xì)胞( MSC)因其具有干細(xì)胞多向分化潛能及易獲取、易擴(kuò)增、低**源性等特點(diǎn)，是*有希望、能方便用于AKI臨床**的干細(xì)胞。

然而，MSC移植的低遷移率和低生存率等因素限制其功能的進(jìn)一步發(fā)揮。為克服上述缺點(diǎn)，采用多種方法對(duì)MSC進(jìn)行體外修飾或處理以期提高移植療效，其中包括基因修飾、體外**預(yù)適應(yīng)、體外低氧預(yù)處理等。本文就近年來(lái)MSC體外修飾方法及在AKI**中的研究進(jìn)展作一綜述。

一、間充質(zhì)干細(xì)胞的主要特性

1968年，F(xiàn)riedenstein等*先對(duì)MSC的特性進(jìn)行描述，認(rèn)為該種細(xì)胞有黏附性、表型呈成纖維細(xì)胞樣并具有多向分化潛能。1999年，Pittenger等**從骨髓中分離MSC (BMSC)。隨后，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道，MSC還能從其他多種中分離，比如脂肪、臍血、胎盤、羊水、皮膚等。

近年來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)MSC的研究日益增加。為了使MSC的研究更標(biāo)準(zhǔn)、更統(tǒng)一化，從而使研究結(jié)果更加具有可比性，2006年，細(xì)胞**協(xié)會(huì)(ISCT)制定了指南來(lái)定義MSC的基本特性：(1)塑料黏附性，即在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；(2)細(xì)胞表面表達(dá)CD73、CD90.CD105，而不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CDllb、CD79a、CD19、HLAII類；(3)具有多向分化潛能，即在體外可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨母細(xì)胞。但是這份指南主要用于規(guī)范人類來(lái)源的MSC。動(dòng)物體內(nèi)分離的MSC，其黏附性和分化潛能基本上與人類保持一致，但有關(guān)抗原的表達(dá)有待進(jìn)一步的確認(rèn)。

*常用于獲取MSC的來(lái)源是骨髓，即BMSC。盡管骨髓中BMSC占的比例較少(占骨髓有核細(xì)胞的0.OOl%-0.01%)，但其易分離、體外擴(kuò)增迅速。BMSC細(xì)胞表面不表達(dá)或低表達(dá)MHC I類和MHCⅡ類分子，具有低**源性，體內(nèi)輸注能避開同種異體T細(xì)胞的攻擊；另一方面可以細(xì)胞**或者先天**途徑，發(fā)揮**抑制。

此外，雖然目前對(duì)于調(diào)節(jié)BMSC分化的機(jī)制尚不明確，但大量研究明，BMSC的分化潛能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過ISCT指南中描述的，即除了能分化為中胚層來(lái)源的成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞外，在特定的環(huán)境中，還能分化成外胚層起源的神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)胚層起源的肝細(xì)胞，和心肌細(xì)胞等。上述特性使得BMSC成為*有希望、能方便用于臨床的干細(xì)胞之一。

二、MSC移植**AKI的機(jī)制

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輸注MSC能有效減輕AKI的腎臟損傷，促進(jìn)腎臟修復(fù)。但對(duì)于MSC移植的腎臟保護(hù)機(jī)制目前仍有爭(zhēng)議。雖然部分研究認(rèn)為輸注的MSC分化為腎小管上皮細(xì)胞而促進(jìn)腎損傷修復(fù)、改善腎臟功能，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，輸注的MSC遷移歸巢至受損腎臟后，分泌促有絲分裂、促血管生成、抗凋亡、**性反應(yīng)等相關(guān)細(xì)胞因子而發(fā)揮腎臟保護(hù)。

1．外源性MSC歸巢至損傷腎臟：

輸注的MSC歸巢到損傷腎臟是細(xì)胞**的首要步驟。腎小管缺血缺氧損傷是AKI的主要病因。腎臟缺血后，機(jī)體釋放一系列炎性因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，從而引發(fā)復(fù)雜的急性炎性反應(yīng)事件。

體外研究發(fā)現(xiàn)MSC能對(duì)炎性反應(yīng)信號(hào)釋放適應(yīng)性**應(yīng)答，從而啟動(dòng)MSC遷移過程。MSC膜表面表達(dá)一系列黏附分子和整合素，如CXCR4、c-Met、VCAM-1、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3等，它們幫助MSC黏附并內(nèi)皮從而到達(dá)壞死腎小管區(qū)域。

其中MSC細(xì)胞表面表達(dá)的CXCR4、c-Met可以和受損腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的SDF-1、HGF等生物因子形成受體-配體關(guān)系，促進(jìn)MSC遷移至受損腎臟部位。即SDF-1-CXCR4和HGF-c - Met軸是MSC黏附歸巢*重要的信號(hào)，可促使MSC招募至損傷區(qū)域，促進(jìn)**。

2．旁分泌：

移植的MSC可以釋放一系列具有細(xì)胞保護(hù)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，后者抗凋亡、促進(jìn)血管生成和促有絲分裂等機(jī)制保護(hù)損傷。下述分子為MSC釋放的*常見的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、p成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(3-FCF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、基質(zhì)源因子1(SDF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p(TGF-(3)、白細(xì)胞介素6（IL-6）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管生成素I(Ang I)、血小板起源的生長(zhǎng)因子(PDGF)、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子( GCSF)。

目前多數(shù)研究認(rèn)為，在AKI腎小管修復(fù)過程中，移植的MSC在部炎性細(xì)胞和因子的刺激下，分泌上述細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子旁分泌的方式抑制部炎性反應(yīng)，修復(fù)受損腎臟。特別是在AKI病程的早期，此時(shí)MSC尚不可能分化為腎小管上皮細(xì)胞，旁分泌功能被認(rèn)為是其早期腎臟保護(hù)的主要機(jī)制。

3．分化或刺激腎臟原位MSC分化為腎小管上皮細(xì)胞：

有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管損傷后的體外條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)MSC表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞表型，提示MSC具有向腎小管上皮細(xì)胞分化的潛能。這些損傷的腎小管會(huì)釋放一系列可溶性損傷因子，包括多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和白細(xì)胞介素等，誘導(dǎo)MSC分化為腎小管上皮細(xì)抱。

體內(nèi)研究顯示，輸注外源性MSC至大鼠AKJ模型，2周后發(fā)現(xiàn)MSC輸注組的腎功能改善較對(duì)照組明顯；同時(shí)植入的MSC表達(dá)水通道蛋白1(AQPl)、儀平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、CK-18等腎小管上皮細(xì)胞特異性，認(rèn)勾移植的MSC分化為腎小管上皮細(xì)胞，參與AKI的腎臟修復(fù)過程。但是，MSC體內(nèi)分化為腎小管細(xì)胞僅占增生腎小管上皮細(xì)胞的少部分，MSC輸注后第8天，分化ISC數(shù)量約占輸注總MSC數(shù)量的0.1%或者更少。

多項(xiàng)研究表明，MSC輸注到AKI模型后，有利出現(xiàn)的時(shí)間早，大約在移植術(shù)后24 h，尚不足以提供足夠的時(shí)間讓MSC分化為腎小管上皮細(xì)胞。至少在受損腎臟修復(fù)的前期過程中，“MSC分化為腎小管上皮細(xì)胞”還不足以解釋AKI后細(xì)胞輸注對(duì)腎臟的修復(fù)機(jī)制。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)腎臟腎小球和近端腎小管有腎臟：細(xì)胞定植，該細(xì)胞表達(dá)CD133、PAX-2、nestin等。輸注的外源性MSC分泌的HGF和IGF-1等腎臟保護(hù)因子，能促進(jìn)腎臟干細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化，促進(jìn)腎臟內(nèi)源性的自我修復(fù)。

三、體外修飾MSC可激發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的**潛能

雖然目前多數(shù)研究支持MSC移植可以**AKI，但仍存在一些問題：(1)輸注MSC只有少量細(xì)胞歸巢到缺血腎，大部分嵌頓在心、肺、脾等其他器官；(2)缺血腎臟的部低氧和炎性反應(yīng)，降低了遷移至此的MSC的存活率；(3)移植MSC歸巢后異常分化為脂肪細(xì)胞。上述問題大大降低了MSC對(duì)AKI的保護(hù)，進(jìn)而限制其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。

近年來(lái)，一些學(xué)者嘗試對(duì)MSC進(jìn)行體外預(yù)處理后再移植，以期解決上述難題。這些預(yù)處理方法包括基因修飾、低氧預(yù)處理和**預(yù)處理等，并初步成效，分述如下。

1. 體外基因修飾策略：

MSC具有低**源性且能趨化、遷移至受損器官參與修復(fù)，因此被視為理想的基因轉(zhuǎn)染介質(zhì)。激肽釋放酶能保護(hù)器官對(duì)抗氧化應(yīng)激的損傷。

Hagiwara等叫將人激肽釋放酶基因轉(zhuǎn)染至MSC(TK-MSC)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TK-MSC能分泌重組人激肽釋放酶，且培養(yǎng)基中釋放的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VECF)較普通MSC高，氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡數(shù)也明顯降低；將TK-MSC左頸動(dòng)脈輸入動(dòng)物模型后發(fā)現(xiàn)，移植后6 h。TK -MSC組腎小管凋亡、誘導(dǎo)型氮氧化物合酶(iNOS)及NO表達(dá)均減少；移植后48 h，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，髓過氧化酶活性降低，腫瘤壞死因子(TNF)儀、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、胞間細(xì)胞黏附分子1(ICAM-1)的表達(dá)下調(diào)，由此實(shí)激肽釋放酶和激肽能抑制H202誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、增加Akt磷酸化和體外培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞的活性。在機(jī)體AKI微環(huán)境中，紅細(xì)胞生成素(EPO)能促進(jìn)MSC的存活、增生和分化。

Eliopoulos等在體外用EPO基因轉(zhuǎn)染至MSC (EPO-MSC)，再將EPO-MSC腹腔注射的方式輸入AKI小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，Epo -MSC在小鼠AKI模型體內(nèi)的生存率較普通MSC高；Epo-MSC組腎內(nèi)EPO表達(dá)上調(diào)，血尿素氮和肌酐水平也下降。分泌VEGF是MSC發(fā)揮腎臟保護(hù)方面的重要因素。

Yuan等將VEGF基因轉(zhuǎn)染至MSC (VEGF-MSC)，并與損傷的腎小管上皮細(xì)胞TCMK-1共培養(yǎng)，TCMK-1在損傷后第3天，細(xì)胞活力下降；與MSC共培養(yǎng)時(shí)，VEGF-MSC對(duì)細(xì)胞的保護(hù)較單純MSC明顯；將VEGF-MSC尾靜脈輸入AKI小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，VEGF-MSC的腎臟保護(hù)優(yōu)于單純MSC，主要體現(xiàn)在腎功能、小管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生存率的改善。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種**調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)血管生成，減少損傷釋放的炎性細(xì)胞因子。

Chen等將HGF體外轉(zhuǎn)染至MSC (HGF-MSC)，后將細(xì)胞左頸動(dòng)脈輸入大鼠AKI模型后發(fā)現(xiàn)，損傷后72 h,HGF-MSC組肌酐和尿素氮下降至基線的速度較MSC組迅速，腎臟充血和腎小管管型的程度較輕。上述結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)捏w外基因修飾能提高M(jìn)SC的**潛能，增加干細(xì)胞增生、減少凋亡，減輕腎炎性反應(yīng)、改善微循環(huán)等機(jī)制，從而更有效的減輕腎損傷、促進(jìn)腎修復(fù)。

2．體外**預(yù)處理策略：

DHA在炎性反應(yīng)環(huán)境中能產(chǎn)生有效的**脂質(zhì)介質(zhì)，比如14S，21R- diHDHA。Tian等在MSC培養(yǎng)基中加入250 nmol/L的14S, 21R -diHDHA，孵育12 h后，將細(xì)胞輸注入小鼠AKI模型體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理組能更有效地減少腎臟結(jié)構(gòu)的改變，降低血肌酐上升的水平，抑制腎小管細(xì)胞的凋亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；在體外試驗(yàn)中，14S，21R-diHDHA預(yù)處理能刺激MSC分泌更多的HGF、IGF-1等腎臟保護(hù)因子，并磷酸肌醇3-激酶-Akt信號(hào)通路提高M(jìn)SC的活力。

同時(shí)，上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果在人MSC中亦得到實(shí)。褪黑素能降低氧化應(yīng)激損傷從而減少損傷，并刺激骨髓系統(tǒng)分泌細(xì)胞因子。Mias等在MSC培養(yǎng)基中加入5pcmoVL褪黑素，孵育24 h后清洗、消化細(xì)胞，并直接注入大鼠AKI模型的腎皮質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純MSC組比較，褪黑素預(yù)處理組MSC的存活率提高，受累腎臟的血管生成增加、腎小管細(xì)胞增生及腎功能改善明顯；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，褪黑素能誘導(dǎo)超氧化劑物歧化酶-1的過度表達(dá)，從而增加MSC的抗凋亡能力；同時(shí)，褪黑素預(yù)處理的MSC高表達(dá)FGF和HCF，從而增加其在體存活率、旁分泌活性和效能。

透明質(zhì)烷。丁酸(HB)是一種合成復(fù)合物，體外能誘導(dǎo)后腎分化，****樣結(jié)構(gòu)形成，分泌血管生成因子。La Manna等口71用l g/L HB體外預(yù)處理MSC(HB-MSC)后將其輸人大鼠AKI模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)HB-MSC組的腎臟炎性反應(yīng)程度略較MSC組低，推測(cè)HB預(yù)處理能增強(qiáng)MSC的修復(fù)誘導(dǎo)能力。

3．體外低氧預(yù)適應(yīng)策略：

正常情況下，骨髓處于低氧狀態(tài)，氧含量為1%~ 7%。目前大部分實(shí)驗(yàn)涉及的MSC是在常氧培養(yǎng)箱中擴(kuò)增得到。事實(shí)上，一旦在體外常氧條件下培養(yǎng)時(shí)間超過24 h，能定向歸巢的MSC數(shù)量就明顯減少；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，隨著體外細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，MSC細(xì)胞表面表達(dá)的包括CXCR4在內(nèi)的黏附分子數(shù)目逐漸減少，對(duì)趨化因子的反應(yīng)能力進(jìn)行性下降。因此常規(guī)的體外培養(yǎng)過程將限制MSC向臟器缺血部位歸巢。

于是Hung等假設(shè)體外低氧培養(yǎng)能提高M(jìn)SC的在體歸巢和遷移能力，他將MSC置于氧含量為1%的環(huán)境中短期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能有效提高M(jìn)SC表面的趨化因子受體CXCR1和CXCR4的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)MSC對(duì)趨化因子CX3和SDF-la的遷移能力，即體外低氧預(yù)適應(yīng)能提高M(jìn)SC的遷移能力。Liu等對(duì)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)在缺血腎臟中，SDF - lα表達(dá)上調(diào)，該因子與MSC表面表達(dá)的CXCR4、CXCR7形成配體。

受體關(guān)系，調(diào)節(jié)MSC向損傷腎臟遷移；低氧培養(yǎng)能促進(jìn)MSC表面CXCR4和CXCR7的表達(dá)；與常氧培養(yǎng)的MSC相比，低氧培養(yǎng)不僅能改善MSC的趨化歸巢和細(xì)胞活力，還能刺激促血管生成和促有絲分裂等細(xì)胞因子分泌。

其中，CXCR4和CXCR7是低氧預(yù)適應(yīng)發(fā)揮旁分泌的重要因子。缺血再灌注發(fā)生24 h后，輸注的低氧預(yù)處理后的MSC能靶向趨化到缺血腎臟，而常氧培養(yǎng)的MSC則不明顯。若封閉CXCR4或CXCR7則削弱低氧預(yù)處理MSC引起的改善的**潛能。該研究實(shí)了低氧預(yù)適應(yīng)SDF -1 - CXCR4/CXCR7途徑調(diào)節(jié)MSC趨化歸巢，提高細(xì)胞活力，促進(jìn)其旁分泌，加速有絲分裂，減少細(xì)胞凋亡，從而改善腎功能。

我們的研究也發(fā)現(xiàn)，化學(xué)低氧預(yù)處理（200 μl/L CoCl2培養(yǎng)24 h）可以增強(qiáng)MSC的體外遷移能力，該與低氧預(yù)處理活化HIF - lα后促進(jìn)CXCR4的轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理可以增加MSC向受損腎臟內(nèi)定植的數(shù)量和延長(zhǎng)在腎臟內(nèi)定植的時(shí)間，從而更有效減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。由于低氧預(yù)處理不需使用額外的生長(zhǎng)因子、病毒或其它非臨床用的**，因此是一種有前景的干細(xì)胞移植策略。

四、結(jié)論

雖然許多研究實(shí)MSC可促進(jìn)AKI腎臟修復(fù)，但是輸注MSC歸巢率低、生存率低等原因，降低了MSC對(duì)AKI的保護(hù)。本文歸納的體外調(diào)控MSC的策略，主要促進(jìn)MSC歸巢、增強(qiáng)歸巢細(xì)胞的旁分泌和***，改善MSC生存微環(huán)境，提高其體內(nèi)生存率，從而增強(qiáng)MSC對(duì)損傷腎臟的修復(fù)。

但MSC**AKI的研究仍存在一些問題需要進(jìn)一步確認(rèn)：(1)MSC促進(jìn)損傷腎臟修復(fù)的具體旁分泌機(jī)制及相應(yīng)信號(hào)通路；(2)外源植入的MSC是否分化為腎小管上皮細(xì)胞，若存在分化，分化的MSC以何種機(jī)制參與損傷修復(fù)；(3)若存在腎臟干細(xì)胞，外源性MSC與腎臟干細(xì)胞如何相互。隨著上述問題的解決，相信人們能更深刻地理解MSC對(duì)AKI的機(jī)制，為后期的臨床試驗(yàn)奠定良好的基石。